致泻并广泛存在于自然界

大肠埃希氏菌作为正常菌群而存在于人和动物肠道中，致泻并广泛存在于自然界。大肠大肠埃希氏菌的埃希某些菌株对人有致病性。人和动物的氏菌带菌是传播本菌引起食物中毒的重要原因。

致泻大肠埃希菌(Eschrichia coli)，标准简称致病性大肠菌。检验根据其致病机制可分为4个类型。致泻肠道致病性大肠菌(Enteropathogenic E．coli，大肠EPEC)，埃希肠道侵袭性大肠菌(Enteroinvasive E．Coli,氏菌EIEC)，产肠毒素大肠菌(EntervtoxigencE．coli，标准ETEC)，检验肠道出血性大肠菌(Entero一hemorrhagic E．coli，致泻EHEC)。大肠EPEC主要引起新生儿的埃希腹泻。EPEC、ETEC引起腹泻腹痛型胃肠炎。EIEC引起的胃肠炎酷似痢疾。EHEC引起出血性大肠炎。

一、检验方法

检样主要为可疑食物、呕吐物、粪便。粪便标本尽可能在患者接受抗菌素治疗前采集。样品采集后，应尽快检验，除了易腐食品在检验之前应冷藏外，一般不冷藏。

(一)分离培养及生化鉴定

无菌称取检样25g，加在225mL营养肉汤中，均质lmin。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶内，于36±1℃培养6h。挑取1环，接种于一管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h。

将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培养18～24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。

自鉴别平板上直接挑取数个菌落，分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI)。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。

FSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H₂S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或H₂S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革蓝氏染色。

(二)血清学试验

假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂培养物，用肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和肠道出血性大肠埃希氏菌0157血清作玻片凝集。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价0血清作试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的0抗原群见表5—1。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。

证实试验：制备O抗原悬液，稀释至与Mac Farland 3号比浊管相当的浓度。原效价为1:160-1:320的O血清，用0.5％盐水稀释至1:40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管中等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50⁰C水浴箱内，经16.h后观察结果。如出现凝集，可证实为该0抗原。

(三)肠毒素试验

产毒培养：将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6 mLCAYE培养基内，37⁰C振荡培养过夜。加入20000IU／mL的多粘菌素B0.05mL，于37⁰C1h，以4000r/min离心15min，分离上清液，加入0.1％硫柳汞0.05mL，于4℃保存待用。

酶联免疫吸附试验检测不耐热的肠毒素(LT)(双抗体夹心法)：

(1)包被：先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5mL，混匀后全部吸出于3.6mL包被液中混匀，以每孔100μL量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4⁰C冰箱湿盒中过夜。(2)洗板：将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。(3)封闭：每孔加100μL封闭液，于37⁰C水浴中1h。(4)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(5)加样本：每孔分别加各种试验菌株产毒培养液100μL，37⁰C水浴中1h。(6)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(7)加酶标抗体：先在酶标I。T抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100μL，37⁰C水浴中1h。(8)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(9)酶底物反应：每孔(包括第一孔)各加基质液100μL，室温下避光作用5～10min，加入终止液50μL。(10)结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上者为阳性。目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。

酶联免疫吸附试验检测耐热肠毒素(ST)(抗原竞争法)：(1)包被：先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液，混匀后部吸出于1.6mL包被液中混匀，以每孔50μL加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第一孔留空作对照。置4℃冰箱湿盒中过夜。(2)洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上，(3)封闭：每孔加封闭液100μL，37℃水浴lh。(4)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(5)加样本及ST单克隆抗体：每孔分别加各试验菌株产毒培养液50μL，稀释的ST单克隆抗体50μL(先在ST单克隆抗体管中加O.5 mL稀释液，混匀后全部吸出于1.6mL稀释液中，混匀备用)，37℃水浴lh。(6)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(7)加酶标记免抗鼠Ig复合物：先在酶标记免抗鼠Ig复合物管中加O.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加lOOμL，37℃水浴1h。(8)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(9)酶底物反应：每孔(包括第一孔)各加基质液100μL，室温下避光5～10 min，再加入终止液50μL。(10)结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值：

目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。

双向琼脂扩散试验检测LT：将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作共做两份，于36℃培养48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃经5～6h，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30μL，用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36^°C经15～20h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。

参考资料：食品卫生微生物检验标准手册

相关链接：大肠埃希氏菌，微生物，伊红美蓝琼脂平板

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