玛咖是相萃一种十字花科独行菜属草本植物,可以药食两用,取法我国卫生部2011年正式审批玛咖粉为新资源食品。玛咖研究表明玛咖可以抗疲劳,多糖的工增强体质,艺研其中玛咖多糖可以提高机体的相萃耐力,具有抗疲劳、取法抗氧化的玛咖功效。因此开展与玛咖及其提取物相关的多糖的工研究,对其进一步的艺研开发、推广利用有着深远的相萃意义。
目前,取法多糖的玛咖传统提取工艺为乙醇沉淀法,此方法虽然能提取出大量的多糖的工多糖,但是艺研存在提取不彻底,原料利用率低,乙醇用量大等问题。三相萃取法提取多糖可以避免醇沉工艺的缺点,其原理是通过在水提液中加入无机盐和有机溶剂使其形成三相,上相为有机层,主要是色素、脂类等极性较小的物质,中间相为蛋白质层,下相为水层,主要是一些水溶性物质。提取结束后,提取液中的有机溶剂和无机盐都可回收,是一种绿色高效提取多糖的工艺。本实验采用用叔丁醇-(NH4)2SO4-提取液三相体系萃取玛咖多糖,并通过响应面试验优化提取工艺,并分析玛咖多糖的抗氧化活性,为玛咖的提纯和开发利用提供科学的参考依据,能让其发挥最大的市场经济价值。
一、材料与方法
1、仪器与试剂
RV10型旋转蒸发仪:德国IKA公司;LD-10型冷冻干燥机:湖南博瑞德生物有限公司;YT-1型分光光度计:无锡尚科仪器有限公司;TENSORII傅里叶变换近红外光谱仪:德国BrukerOptics公司。
2、样品来源
实验所需玛咖随机购于当地药材市场。
3、实验方法
(1)玛咖多糖三相萃取工艺流程
玛咖→粉碎→蒸馏水提取→水提液浓缩→加入(NH4)2SO4、叔丁醇→混匀→静止萃取→分离、冷冻干燥→玛咖多糖
(2)玛咖多糖三相萃取工艺要点
蒸馏水提取:将10g玛咖粉按料液比1:30(g/mL)加入蒸馏水,50℃水浴30min,提取1~4次。水提液浓缩:将提取液在50℃条件下旋转蒸发,浓缩至100mL。加入(NH4)2SO4、叔丁醇:在提取液浓缩中加入10%~50%添加量的(NH4)2SO4,再加入5~25mL的叔丁醇,形成三相体系。
混匀、静止萃取:充分混匀后,于20℃~60℃温度下静置萃取60min。分离、冷冻干燥:萃取后,形成三相;上层为叔丁醇相,主要含有脂类物质,黄酮类;中间为相为蛋白质;下层为(NH4)2SO4相,主要含有玛咖多糖,并通过分子透析法除去无机盐后冷冻干燥得到玛咖多糖。
(3)玛咖多糖提取率的计算
采用苯酚-硫酸法测多糖含量,以外标法测定玛咖多糖质量,并计算得到多糖提取率,计算公式如下:
玛咖多糖提取率/%=(玛咖多糖质量/玛咖粉质量)×100
(4)单因素实验对玛咖多糖提取条件的优化
实验称取10g玛咖粉,以水提法分别提取1、2、3、4次,合并提取液浓缩至100mL,以三相萃取法提取玛咖多糖,提取浓缩并冷冻干燥后制得玛咖多糖,测定玛咖多糖含量并计算提取率。分别研究(NH4)2SO4添加量10%、20%、30%、40%、50%,叔丁醇添加量5、10、15、20、25mL,萃取温度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的条件下,对玛咖多糖提取率的影响。
(5)响应面实验对玛咖多糖提取条件的优化
根据单因素实验得到的结果,选取(NH4)2SO4添加量,叔丁醇添加量、萃取温度3个因素,采用Design-expert8.0软件进行响应面实验设计,试验因素与水平见表1。
(6)玛咖多糖清除·OH能力的测定
参照水杨酸法,分别取0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL玛咖多糖溶液各2mL置于10mL的试管中,再加入2mL硫酸亚铁(0.005moL/mL)、2mLH2O2,静置5.0min后,再加入2mL的水杨酸溶液(0.005moL/mL),在37℃温度下水浴10min,波长510nm条件下测定吸光度X值。X0为空白对照组的吸光度值,X1为蒸馏水代替玛咖多糖溶液的吸光度值,X2为玛咖多糖溶液的吸光度值,并以维生素C作为对照组,·OH清除率计算公式如下所示:
(7)玛咖多糖清除DPPH·能力的测定
参照相关文献,准确吸取2mL浓度为0.2mmoI/LDPPH·甲醇溶液置于10mL的试管中,再分别加入浓度2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/m的玛咖多糖溶液各2mL,并在37℃水浴条件下反应10min,于波长517nm条件下测定吸光度值X。X0为空白对照组的吸光度值,X1为加入玛咖多糖溶液后吸光度值,并以维生素C作为对照组,DPPH·清除率计算公式如下所示:
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