疗冠涉及134个交集靶点

目的基于究麝基于血清药物化学与网络药理学探究麝香通心滴丸治疗冠心病的机制。方法采用HPLC-Q-TOF/MS联用技术分析麝香通心滴丸的血清学探香通心滴心病入血成分。条件为Hydro-ＲP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，药物药理4μm);流动相0.4%甲酸乙腈-0.2%甲酸，化学梯度洗脱;体积流量1.3 mL/min;进样量10μL。网络丸治利用PharmMapper服务器、疗冠GeneCards数据库预测和筛选麝香通心滴丸入血成分治疗冠心病的基于究麝作用靶点，String数据库绘制蛋白相互作用网络，血清学探香通心滴心病Cytoscape软件构建成分-疾病-靶点网络图，药物药理借助David数据库对靶点进行GO分析和KEGG通路分析，化学使用Autodock Vina软件对入血成分和核心靶点进行分子对接。网络丸治结果共得到8种入血成分，疗冠涉及134个交集靶点，基于究麝可能通过ErbB signaling pathway、血清学探香通心滴心病VEGF signaling pathway、药物药理PPAＲsignaling pathway等信号通路治疗冠心病，且分子对接显示入血成分与核心靶点结合性较好。结论麝香通心滴丸8种入血成分可能是其治疗冠心病的物质基础，可为深入阐明该制剂作用机制提供一定的依据。

“血清药物化学”这一理论最先由德国科学家格哈德·多马克所提出，后来我国科学家王喜军教授提出符合中医药理论的中药血清药物化学。中药成分较为复杂，经口服给药后，普遍认为发挥药效的活性成分应该是被吸收入血的成分。通过分析口服给药后血中成分，可确定中药在体内直接起作用药效成分。网络药理学通过生物学网络中节点的连接和关系来分析药物对疾病网络的干预，从整体效应角度预测药物靶点，是阐明中药复方作用机制的重要手段之一。近年来文献报道的网络药理学研究大多数是以各数据库中成分的口服生物利用度为筛选指标。然而多味中药在组成复方后，其原本的一些成分在其它成分的协同作用下，会使其原本较低的生物利用度得到改善，并且更改相应的药物剂型也会提高其生物利用度。因此对于多成分的中药复方制剂，仅靠数据库中的口服生物利用度为筛选指标，会导致靶点预测不够精确。麝香通心滴丸为内蒙古康恩贝药业有限公司圣龙分公司已上市产品，收载于2015年版《中国药典》一部，于2017年1月13日被列入国家中药保护品种，全方包括麝香、蟾酥、人参茎叶总皂苷、丹参、人工牛黄、熊胆粉、冰片，该品种属于心脑血管领域用药。虽然临床上治疗冠心病疗效显著，但其药效物质基础并不明确。本文通过HPLC-Q-TOF/MS对麝香通心滴丸进行血清药物化学研究，并基于网络药理学对入血成分治疗冠心病的作用机制进行研究，为深入阐明麝香通心滴丸作用机制提供一定的依据。

1材料

1.1仪器

1260高效液相色谱仪、6530 Q-TOF/MS四极杆飞行时间质谱仪(美国安捷伦公司);高速冷冻离心机、涡旋振荡器(美国赛默飞世尔科技公司);Sartorius BS210S十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)。

1.2试剂与药物

麝香通心滴丸(内蒙古康恩贝有限公司圣龙分公司，批号180607)。蟾毒灵(批号111981-201501，纯度99.2%)、熊去氧胆酸(批号110755-201704，纯度99.4%)、脂蟾毒配基(批号110718-201809，纯度98%)购自中国食品药品检定研究院;远华蟾毒精(批号PS010798，纯度98%)、去乙酰华蟾毒精(批号PS010804，纯度98%)购自成都普思生物科技股份有限公司;沙蟾毒精(批号5283，纯度98%)、甘氨胆酸(批号6723，纯度98%)购自上海诗丹德标准技术服务有限公司;牛磺胆酸(批号PST190801-061，纯度98%)购自成都乐美天医药科技有限公司。乙腈(批号SHBK3440，色谱纯)、甲醇(批号10958407824，色谱纯)购自默克化工技术(上海)有限公司。

1.3动物

5只SPF级健康雄性SD大鼠，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(沪)2013-0016，由浙江中医药大学动物实验中心代为饲养，使许可证号SYXK(浙)2013-0184，条件为温度(22±1)℃，相对湿度50%～60%，12 h光照，通风频率15～20次/h。大鼠以标准饲料喂养，饮水自由，伦理审查决议编号ZSLL-2017-054。

2方法

2.1麝香通心滴丸入血成分分析

2.1.1麝香通心滴丸混悬液制备

取适量麝香通心滴丸粉研磨成粉末，加入适量0.5%羧甲基纤维素钠溶液，调整质量浓度为0.4 g/mL，即得，摇匀备用。

2.1.2动物给药与血清样品采集

SD大鼠给药前禁食12 h，自由饮水，以6.4 g/kg剂量给药。给药前采集空白血样，在给药15、30、45、60 min后眼眶取血各约0.5 mL，收集至EP管中静置30 min，室温下以3 000 r/min离心10 min，取上层血清，备用。

2.1.3血清样本处理

分别精密吸取200μL空白血清和含药血清(将“2.1.2”项下4个时间点含药血清各吸取50μL混匀)于1.5 mL EP管内，加入5倍量甲醇涡旋5 min，离心(4℃、10 000 r/min)10 min，上清液于常温下氮气吹干，100μL甲醇复溶，涡旋5 min，离心(4℃、10 000 r/min)5 min，取上清液供MS分析。

2.1.4色谱条件

Hydro-ＲP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，4μm);流动相0.4%甲酸乙腈(A)-0.2%甲酸水(B)，梯度洗脱(0～5 min，5%A;5～13 min，5～20%A;13～40 min，20～22%A;40～60 min，22～45%A;60～75 min，45～75 A%);柱温30℃;体积流量1.3 mL/min;进样量10μL。

2.1.5质谱条件

离子源ESI，扫描方式ESI+、ESI-模式;干燥气体温度320℃，体积流量10 L/min;鞘气温度350℃，体积流量12 L/min;碎裂能量175 V;毛细管电压3 kV;正负离子采集范围m/z 50～1 500。

2.2网络药理学研究

2.2.1预测潜在靶点

将分析得到的麝香通心滴丸入血成分通过PubChem数据库得到其mol2格式文件，并将其上传至PharmMapper服务器(限定靶蛋白为人类，其余为默认选项)，采用“药效团匹配方法”得到虚拟筛选结果。将筛选出的分子-靶点匹配度(Fit Score)大于等于3的药物靶点作为靶蛋白，并通过UniProt数据库输入筛选得到的蛋白靶点PDBID，经检索和转化操作得到的麝香通心滴丸入血成分的潜在作用靶点。通过GeneCards数据库，以“coronary atherosclerotic heart disease”为关键词，检索与冠心病相关的基因，并与上述成分靶点匹配进行分析，筛选与麝香通心滴丸入血成分相关的作用靶点。

2.2.2蛋白相互作用网络构建与分析

String数据库是一种包含已知和预测蛋白质与蛋白质相互作用的数据库，将上述成分-疾病交集靶点导入String数据库，限定物种为人类(Homo sapiens)，最低相互作用阀值设为高等置信度0.9“highest confidence”，同时显示设置隐藏游离点，然后下载PPI图形件并保存tsv文件，最后使用Ｒ语言对得到的PPI进行核心基因的筛选，其余参数保持默认设置。

2.2.3靶标GO富集分析和KEGG通路富集分析

本研究通过David 6.7数据库，对成分-疾病交集靶点蛋白进行GO富集分析、KEGG通路富集分析，其中GO富集分析包括生物过程(biological process)、分子功能(molecularfunction)和细胞组分(cellular component)3个部分，Select Identifier设置为Official GeneSymbol，List Type设置为Gene List，限定物种为人，并用FDＲ错误控制法对P值作检验校正，最终以“P＜0.05”作为条件进行筛选，筛选出具有显著差异的代谢通路。

2.2.4入血成分与核心靶点的分子对接

对上述麝香通心滴丸的入血成分与核心靶基因进行分子对接，首先通过PubChem数据库得到各分子的化学结构式。在PDB数据库检索靶基因蛋白构象，并根据以下条件筛选:通过X晶体衍射法获取的蛋白结构;蛋白的晶体解析度小于3;分型明确的蛋白。然后，使用AutoTools对蛋白进行加氢去除水分子预处理，AutoGrid进行能量格点计算，AutodockVina进行小分子与蛋白对接，对每个对接进行结合能(affinity)评分，PyMoL作活性分子和蛋白的互相作用图。

声明：本文所用图片、文字来源《中成药》2020年10月，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

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